Agent spécial Leroy Jethro Gibbs : C'est le chef de l'équipe du NCIS. Ancien marine, divorcé de trois femmes rousses, il a perdu sa femme et sa fille dans une attaque. Homme très professionnel, il n'hésite pas à frapper le dos de la tête de DiNozzo et(mais moins souvent) de McGee, et même, quelquefois, de Ziva, alors qu'il n'avait jamais osé taper derrière le crâne de Kate. Il est le modèle de DiNozzo et McGee. Bien qu'il ne l'avoue pas vraiment, Gibbs éprouve une sorte d'affection particulière envers McGee, même si cette affection n'est pas comparable à celle qu'il éprouve pour Abby ou à l'amitié qui le lie de longue date à Ducky.
Agent spécial Antony « Tony » DiNozzo : C'est l'un des assistants de Gibbs, il est passionné de cinéma. Mais après ce qui est arrivé à Kate, il change radicalement même s'il ne veut pas l'admettre. Gibbs a confiance en Tony et n'hésite à le laisser gérer la situation quand sa vie en dépend (bête noire). Tout comme son acteur Michael Weatherly,
Agent spécial Caitlin « Kate » Todd : Ancien agent des services secrets, ayant notamment assuré la protection du président des États-Unis d'Amérique, elle collabore dans le premier épisode avec le NCIS sur un meurtre à bord d'Air Force One. Elle démissionne de ce service pour avoir couché avec un militaire et pour ne pas avoir suivi les ordres de ses supérieurs. Elle a un faible pour Ari. Dans ses années au collège elle participe à un concours de T-shirt mouillé que Tony découvre et qu'il utilise par la suite pour la faire chanter. Elle entretient une relation amicale compliquée avec Tony, une relation professionnelle ambiguë avec Gibbs et une relation amicale avec Abby puisque celles-ci partent souvent en vacances ensemble. Kate n'a jamais eu le moindre respect envers McGee, puisque les rares moments où elle ne se disputait pas contre DiNozzo étaient ceux qu'elle passait avec ce dernier à humilier McGee.
Abigail « Abby » Sciuto : C'est la scientifique de l'équipe. C'est une extravertie au look extrème gothique, voir punk, elle dort dans un cercueil, a toujours des couettes, ou des macarons, et du rouge à lèvres rouge ou noir, elle se promène toujours avec son « caf-pow ». Elle a une relation avec McGee. Elle a plusieurs tatouages : une toile d'araignée au cou, des triangles sur le poignet, le symbole de l'infini, une grande croix gothique dans le dos, et d'autre non divulgués. Abby et Gibbs s'entendent très bien, comme un père et sa fille, ils parlent le langage des signes ensemble car les parents d'Abby sont sourds. Elle s'entendait aussi très bien avec Kate, qui est morte, et d'une façon générale avec le reste de l'équipe.
Agent spécial Timothy « Tim » McGee : Ancien étudiant à Norfolk, diplômé du MIT, il est expert en informatique. Peu confiant en lui, il est surnommé « le bleu » par Tony, plus rarement par Abby lorsqu'elle est énervée par la naïveté de celui qu'on appelle en général simplement par son nom, McGee. Cependant, il n'est pas véritablement peureux ni même incompétent, bien au contraire. De stagiaire en informatique à ses débuts, il passe agent du terrain à plein temps lors de la deuxième saison. Il a l'occasion vers la fin de celle-ci (épisode Enchaînés) de faire preuve de courage face à la hiérarchie en déclarant « Allez vous faire voir » à la Secrétaire d'état, sur un conseil de Gibbs. Après la mort de Kate, son caractère s'affirme et il devient même de plus en plus indispensable.
Docteur Donald « Ducky » Mallard :Il a étudié en Écosse dans le but de devenir médecin légiste. Son intervention est bien souvent indispensable pour lancer le début d'une enquête. Il est très bavard et parle à ses patients qui sont évidemment morts, et sa très large culture générale alimente ses monologues. Il partage également son vécu, même si ce point embête parfois ses collègues. Il parle également très bien le français (saison 4).
Il connaît bien Gibbs, sûrement plus que tous les autres membres de l'équipe, Il est ainsi un des seuls à l'appeler par son prénom, Jethro. Apprécié, mais pas ménagé par les autres membres de l'équipe, le travailleur de l'ombre « Ducky » connaît aussi ses épisodes de gloire.
Sa mère (qui a presque 100 ans), probablement victime de la maladie d'Alzheimer (« une forme de démence », dit Ducky), apparaît dans quelques épisodes. Parmi ses faits d'armes, elle s'éprend brièvement d'un « beau jeune homme », Gibbs. Elle s'imagine que Ducky et Abby sont mari et femme et considère DiNozzo (chargé de la protéger dans Vengeance d'outre-tombe) comme un gigolo, séduite par son nom italien, aussi bien que comme un malfrat.
Officier Ziva David : Ziva David est un agent de liaison du Mossad rattachée au bureau du NCIS de Washington au début de l'épisode 3x04 (Trésor de guerre). Elle est spécialiste des interrogatoires sous forme de torture et peut se montrer dissuasive. C'est un agent très bien entraîné et qui utilise le lancer de couteau. Elle adore taquiner Tony et est très colérique. Et précisons le, elle est la demi-s½ur de Ari Haswari (le tueur de Kate). S'entendant très bien avec McGee à ses débuts au NCIS (ce qui avait pour don d'agacer DiNozzo), elle le prendra pourtant en grippe en croyant se reconnaître sous un mauvais jour dans un roman, pourtant totalement fictif, que McGee a écrit.
Jimmy Palmer : Assistant du Docteur Mallard (d'abord stagiaire, Mallard remarque après l'avoir engagé à plein temps qu'il est l'un de ses seuls assistants qui ne soit pas dégoûté par un cadavre humain dans L'Affrontement) remplaçant Gerald après sa blessure, il est jeune, porte des lunettes et est lui aussi un peu naïf. Son aide est souvent utile pour les enquêtes du NCIS. C'est un spécialiste des remarques à contre-temps (et de l'humour noir, qui effraie parfois Abby : « et une oreille gauche pour le chef », lance-t-il en s'adressant à Ducky à propos d'un cadavre méticuleusement haché), provoquant le regard courroucé du Docteur Mallard ou de Gibbs. Comme on l'apprend dans l'épisode Puzzles humains, Palmer est passionné par le catch (comme la mère de Ducky Mallard) et il est toujours impressionné par l'étendue du savoir de Ducky. On se rend compte dans l'épisode Ultime recours qu'il prend la même habitude que le docteur Mallard, à savoir... parler à ses morts (il est d'ailleurs surpris par Abby dans cette attitude excentrique). Il entretient une liaison avec l'agent Lee avec qui il a plusieurs fois « fricoté » dans la morgue provoquant plusieurs situations assez embarrassantes et hilarantes.
Jennifer « Jenny » Shepard : directrice du NCIS à partir de 2005, est une ancienne équipière de Gibbs avec lequel elle entretenait une aventure. Leurs rapports professionnels sont souvent « inversés » : il n'est pas rare que Gibbs la conseille de manière un peu directe.
Jen est secrètement amoureuse de Gibbs.
